Nanoflow LC/MS는 Proteomics 연구분야의 정성과 정량분석에 있어 고감도를 제공하기 때문에 널리 이용되어왔다. 하지만 통상적으로, Tubing과 컬럼, High-Voltage Electrode와 Emitter 사이의 작은 결함들이 있을 경우 데이터의 재현성이 떨어지는 문제들이 있어왔다. 또한, 가끔은 적당하지 않은High Voltage 연결은 스프레이를 불안정하게 해서 원하는 결과를 얻지 못하는 경우가 있다.

이와 같은 문제들을 해결하고자, Thermo Scientific사의 EASY-Spray Nano-Electrospray Ion Source는 그림 1과 같은 구성으로 출시되었다. 이 나노소스는 그림 2와 같이 Thermo Scientific사의 EASY-Spray 컬럼에 온도, High-Voltage Electrode와 Emitter가 하나로 구성되었다.
EASY-Spray 컬럼은 설치하기 쉽고 높은 재현성을 제공한다. EASY-Spray 컬럼은 PEEK Sleeve 연결의 조립을 생략한 Zero-Dead-Volume(ZDV)의 Thermo Scientific사에서 제공하는 nano Viper의 Fingertight로 연결되었다. Nano Viper 조립은 1000bar의 압력을 견딜 수 있으며 nano-LC와 연결하는데도 별도의 도구를 필요로 하지 않는다. 불완전한 연결 요소를 제거한 EASY-Spray는 예술에 가까운 훌륭한 Nanospray를 구형하여 비전문가라도 쉽게 좋은 데이터를 얻을 수 있도록 디자인되었다.
반면에, Chip-base의 nanoflow System은 매우 짧은 Microfluidic 컬럼을 사용하는 것을 통해서 연결과 관련된 문제를 해결하고자 시도했다. 이러한 컬럼은 전형적으로 분리능과 샘플 적재량에 제약을 받는다. 이와는 달리, EASY-Spray 컬럼은 15cm, 25cm와 50cm의 길이를 선택해서 사용할 수 있어 복잡한 혼합물을 분해능으로 분리할 수 있다.

본 연구의 목적은 간단히 고성능 nanoflow LC/MS의 EASY-Spray 나노소스와 컬럼의 성능을 테스트하고자 한다. 크로마토그래픽 분리능과 머무름 시간(RT)의 재현성, 샘플 주입량과 컬럼의 내구성을 포함한 크로마토그래픽 성능에 있어 모든 중요 파라미터들을 평가하고자 한다.

1)EASY-Spray Column Concept

그림 2는 EASY-Spray 컬럼의 구성으로 디자인 된 개략도를 보여준다. 정확한 정위치에, Diamond-polished, 5um i.d. Fused-silica emitter가 장착되도록 되어있으며 안정적으로 스프레이될 수 있게 EASY-Spray 나노소스에 연결되어 있다. 아울러, EASY-Spray 나노소스를 사용하지 않을 때는 나노 소스 탈착 시 팁 커버가 나와 팁이 손상되는 것을 보호하도록 디자인 되어있다. 샘플은 EASY-Spray 컬럼에 직접 주입할 수 있거나 EASY-Spray 컬럼에 주입하기전에 Trap 컬럼으로 Desalting시킨 후 주입할 수도 있다.

2)Sample

간단히 BSA 와 Complex Digest Mixtures(E. coli and Human Cell)을 사용하였다.
-BSA: 100 fmol/ul
-E.Coli digests: 500ng/ul
-Human cell(k569) digests: 1ug/ul

3)Nano-LC

Thermo Scientific EASY-nLC 1000 nano-LC system을 사용하였다. EASY-Spray 컬럼의 두 가지 타입(50um i.d. x 15cm와 75 um i.d. x 50cm)은 2um의 Thermo Scientific Acclaim PepMap RSLC C18 비드를 사용하여 충진되었다. 다양한 유속(150nL/min, 300nL/min, 400nL/min과 500nL/min)과 컬럼 온도 변화에 따른(35°C, 45°C와 55°C), 각각 피크의 면적, 분리능, 머무름 시간의 재현성, 샘플 주입과 컬럼의 내구성을 테스트 했다. 모든 실험에서 샘플은 컬럼에 직접 주입하였으며 각 샘플은 1ul씩 주입해서 분석했다.
Mobile Pahse:
A: Water containing 0.1% Formic acid(0.1% FA water)
B: Acetonitrile containing 0.1% Formic acid

4)Mass Spectrometery

EASY-Spray source는 Thermo Scientific사 Orbitrap Velos Pro와 Orbitrap Elite Hybrid Ion Trap-Orbitrap 질량분석기로 테스트 했다. 이온화를 위해서, Spray Voltage 1.8kV와 Ion Transfer Capillary 온도 250°C에서 실험하였다.
Orbitrap Elite MS: One full MS scan(60,000 resolution) followed by 20 rapid CID MS/MS scans
Orbitrap Veols Pro MS: One full MS scan(30,000 resolution) followed by 15 CID MS/MS scans

1)High Column Efficiency and Better Chromatographic Resolution

그림 3과 같이 BSA의 100fmol에 대해서 Ultra-sharp인 3.5s 피크(Full Width Half Maximum-FWHM)를 확인했다.

그림 4는 500ng의 E.coli Digest의 Base Peak 크로마토그램이다. 이 데이터는 300nL/min에서 Orbitrap Elite로 수집한 것이며, 60분 Gragient 조건에서 1000 unique 단백질이 확인되었다. 아울러, 그림 5와 같이 유량이 낮고 높은 것에는 거의 차이 없이 높은 컬럼의 분해능으로 인하여 유사한 최대 Peptide Coverage를 보여주었다. 또한, 높은 컬럼 효율과 큰 샘플 적재량은 50cm의 긴 컬럼을 사용해서 실행되었다. 그림 6은 1000ng의 Human Cell(k569) Digest를 Orbitrap Elite 장비에서 수집한 Base Peak 크로마토그램이다. 4000 unique이상의 많은 Protein이 240분 gradient 분석으로부터 확인되었다.

2)Outstanding Retention Time Reproducibility

머무름 시간의 재현성은 Label Free Quantitation Workflow에 있어서 매우 중요한 요소이다. 따라서 EASY-Spray 컬럼의 머무름 시간에 관한 재현성을 평가하기 위해서 500ng의 E.coli Digest 샘플을 35°C 컬럼 온도에서 다양한 유속(150nL/min, 300nL/min, 400nL/min, 500nL/min)과 고정된 유속 300nL/min에서의 다양한 컬럼 온도(주위 온도, 35°C, 45°C, 55°C)조건에서 서로 비교해 보았다. 참고로, 모든 결과는 각 조건에서 20번 이상의 반복 테스트를 한 것들이다.

그림 7은 E. coli Digest의 Base Peak 크로마토그램이다. 머무름 시간의 재현성은 45번의 injection에도 불구하고 모두 거의 흔들림없이 관측되었다. 그림 8과 같이 다양한 컬럼 온도 조건에서 20번씩 반복 주입한 것으로, 머무름 시간의 재현성은 E. coli Peptide (EAVNQVIALLDSGALR)으로 변화계수(Coefficient of Variation, CV)가 실온에서 0.4%, 35°C, 45°C와 55°C에서 0.3%인 것으로 관측되었다. 머무름 시간의 CVs는 그림 9에서 보듯이 검출된 E. coli Peptide (EAVNQVIALLDSGALR)는 서로 다른 유속에서 각 20번씩 반복한 결과, 0.4%CV 이하로 측정되었다.

3)Column Robustness

EASY-Spray 컬럼(Acclaim PepMap RSLC C18, 50um i.d.x 15cm, 2um)의 수명을 테스트하기 위해 500ng E.coli Digest 샘플을 200번 주입했다. 그림 10은 첫 번째 분석과 200번째 분석의 Stacked Base Peak 크로마토그램을 비교한 것이다.

4)Column-to-Column Reproducibility

서로 다른 컬럼에 대한 재현성은 EASY-Spray 컬럼(Acclaim PepMap RSLC C18, 50um i.d. x 15cm, 2um)세 개로 테스트 했다. 그림 11은 세 개의 각 컬럼에서 E. coli Digest 샘플의 Stacked Base Peak 크로마토그램을 비교한 것으로 세 개의 컬럼에서 얻은 각각의 결과가 모두 매우 유사한 컬럼의 분리능과 머무름 시간을 보여주고 있다.

5.Conclusion

EASY-Spray 나노소스는 온도 조절이 가능하며 LC를 Dead Volume이 없는 Nano Viper로 연결하여 MS와 연결 시 뛰어난 nanoflow LC/MS 결과를 얻을 수 있다. EASY-Spray 컬럼은 Dead Volume이 없고 좁은 FWHM을 가진 좁은 피크들의 우수한 결과를 얻을 수 있다. EASY-Spray 컬럼은 최대한 Peptide Coverage를 얻기 위해 고분리능 효율과 분해능을 위해 15cm, 25cm와 50cm의 길이를 선택해서 사용할 수 있다. 반면에, Chip-Base Microfluidic System은 짧은 컬럼과 제한적인 분리능과 적은 샘플 주입량 그리고 무엇보다 온도 조절이 되지 않는 상태로 사용해야 하는 시스템이다.

새로운 EASY-Spray 컬럼은 본 실험에서와 같이 단일 컬럼과 컬럼대 컬럼을 테스트한 것을 통해서 다양한 유속과 컬럼 온도를 조절함으로 뛰어난 재현성의 좋은 결과들을 얻을 수 있음을 테스트 결과들을 통해 확인할 수 있었다. 아울러 EASY-Spray Emitter의 높은 내구성을 또한 확인할 수 있었다. 결론적으로, EASY-Spray 나노소스는 사용이 쉽고 내구성이 좋으며 재현성이 좋은 결과를 획득할 수 있기에 MS 전문가이든 비전문가이든 모두가 쉽게 Nanoflow HPLC를 이용한 Proteomics연구 분야에 쉽게 접근할 수 있다.