Metabolite Profiling과 Identification을 위한 HR/AM 질량분석기의 전략과 전용 소프트웨어 소개!
 
 

영양가와 질적, 내성과 맛은 일련의 농업국가에 분포되어있는 건강, 보건, 영양의 질을 높이는 문화 속에서 정부와 식품산업에 의해 그 특성이 결정되어 왔다. Metabolomics는 질량분석기를 기반으로 해서 형질과 같은 분석에 접근하는데 확인되어져왔다. 본 연구에서는, 토마토 샘플의 Metabolite Profiling과 Identification 실험의 결과를 보여주고자 한다.

서로 다른 토마토 품종사이에 신진대사의 뚜렷한 차이를 밝혀내기 위해, 발육과 완숙 과정을 통해서, 완숙의 신진 대사와 발생 근원을 이해하는 것을 연구했다. Wild-Type(WT)과 세 가지 완숙 정도를 억제한 토마토 변화는 13 발육과정에서 선택된 토마토로 Metabolite Profiling을 실행했다.

토마토의 네 가지 변종은 하나로 통합된 영역의 생물공학과 생물학의 자연과학 연구 협회(Biological Science Research Council)의 Exploiting Systems Biology에 따라 개화기, 과실기, 원숙기 과정을 표본으로 재배했다.
토마토에서 극성과 비극성으로 추출한 것은 Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry를 이용한 Untargeted Metabolomics 연구로 주제를 정하였으며 세 가지 미완숙된 토마토와 일반적인 토마토가 과실기를 거치는 동안의 차이를 비교하는데 있다. 성장 과정은 15, 20, 25, 30일 그리고 40일의 개화기를 지난 후이며, Breaker Stage(BR)로는 과실이 처음으로 색을 띄기 시작하는 때(대략 47일 +/- 하루); 그리고 1, 2, 3, 4, 5, 6일 그리고 BR 이후 7일이다.
모든 과실기 과피는 액체 질소에 침전 시키고 가루로 된 과일 세포 결과는 차후의 추출로 사용되었다. 세 개의 분석 방법은 13발육 과정에서의 네 가지 토마토 변화를 반복하면서 분석했다. 비교 분석은 이미 알려진 방법을 참고했다.(문헌 1-4)

분리는 역상 C18 컬럼(2.1 x 150 mm, 1,7um particle size)과 UHPLC 시스템을 이용했다. 용매는 0.2% Formic acid가 포함된 Water(A)와 98:2:0.2 Acetonitrile/Water/Formic acid(B)를 사용했다. Gradient 조건은 100% A, 2.5min동안 0.2ml/min으로 흘린 다음 10% B로 서서히 올린 다음 7.5분 후 유속 0.4ml/min으로 증가시키고 10분 뒤, 100% B로 2분 동안 바꾼 뒤, 초기 조성으로 18분 동안 안정화 시켰다.

MS Data는 Thermo Scientific Orbitrap Mass Spectrometer를 이용해서 Positive 이온을 검출했다. 질량범위는 m/z 85-900에서 30,000 FWHM Resolving Power에서 분석했다. MS/MS Spectra는 Data Dependent Analysis(DDA)에서 Metabolite MS/MS로 확인 하는데 사용되었다. Top 3의 Precursors를 선택해서 50%의 Collision Energy로 HCD Fragmentation을 얻었다. 질량분석기는 연속적인 샘플 주입 전에 Mass Calibration을 했다. 모든 데이터는 External Calibration 조건에서 획득했다.

Thermo Scientific SIEVE 2.0 소프트웨어는 Data Processing, Alignment, Peak Detection 그리고 ChemSpiderTM 검색과 Elemental Composition을 이용한 Metabolite Identification을 했다. 이 소프트웨어는 전체의 데이터 세트에서 성분마다의 양적인 비교가 가능하다. Umetrics SIMCA-PTM 소프트웨어는 통계분석을 위해 사용되었다. Profiling은 성장단계별 차이(Pair-Wise Fashion), 두 개의 토마토 변화의 Metabolite Profiles의 직접 비교 또는 동일한 토마토 간의 변화를 두 개의 발육 단계에서 비교했다. Thermo Scientific Mass Frontier 소프트웨어는 MS/MS를 통해 Metabolite의 구조적인 정보를 결정하고 확인하는 데 이용되었다.

Metabolite Identification은 기본적으로 두 가지 접근 방식이 있다. 첫 번째는, Accurate Mass는 Elemental Composition을 추측하는데 사용되고, Library에서 Metabolite Identification을 예측할 수 있다.(그림 2), 두 번째는, CID와 HCD MS/MS의 Product Ion Data는 Mass Frontier 소프트웨어를 이용하여 이론적인 Fragmentation과 비교해서 해석한다. 첫 번째 결과에서 얻은 Elemental Composition으로 가질 수 있는 구조를 Mass Frontier 소프트웨어를 이용해서 MS/MS 데이터와 이론적인 Fragmentation Patterns을 비교해서 구조를 결정한다. (그림 3)
우수한 Chromatographic 성능은 짧은 분석 조건에서 백여개 성분들을 분리하여 확인할 수 있다. Orbitrap의 경우 좋은 내구성 덕분에 External Calibration 조건에서도, High Mass Accuracy로 검출되고 짧은 Retention Time에서도 서로 다른 시간에 분리되어, Elemental Composition으로 정확하면서도 다양하게 Metabolite 구조분석을 할 수 있다. (그림 2-5) Elemental Composition이 이론적으로 일치한 것이 한 가지 이상일 때, Metabolite Identification의 유효성은 관측된 스펙트럼에서 세평에 의해 확인된 Metabolites의 in silico MS/MS 스펙트럼의 구조결정에 의해 추가적으로 제공된다.(그림 3) 어떤 경우에는, 표준시료가 MS2 Fragmentation Patterns뿐만 아니라 Chromatographic Retention Time 모두 일치하는 지의 여부에 따라 확실히 확인하는 것을 가능하게 한다.
그림 2A는 Processing 소프트웨어를 통해서 Glutamic Acid가 토마토 QC 샘플에서 검출된 것을 보여준다. 제일 위에 있는 창은 TIC Chromatographic Profile이며, 중간에 있는 창은 1.53분에 획득 된 Full MS이다. 그림 2B는 SIEVE 소프트웨어에서 Wild-Type 샘플 BR 대비 BR +7일 샘플끼리 비교한 것으로 상보적인 피크 검출을 할 수 있는 방법이다. 제일 위에 있는 창은 두 그룹 사이에 세 배의 감도가 차이나는 것을 보여주며, 두 번째 창은 두 그룹(Ratio 3.67)대비 log p-value에 대한 log ratio의 Volcano Plot을 보여준 것이다.
마지막 창은 ChemSpider 탐색으로 확인 된 가능성 있는 Metabolite를 확인한 것으로, 특히 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)데이터베이스에서 검색한 것이다.
(http://www.genome.jp/kegg/)

Metabolic Trajectory에서의 다변량 해석의 차이는 토마토 품종을 관측하고 핵심적인 Metabolite 차이를 확인했다. 그림4와 테이블1은 WT 대비 BR의 완숙을 억제한 토마토의 Metabolite Profiling을 보여주고 그 결과가 상이함을 보여준다.
주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA)을 SIMCA-P를 이용해서 분석했다. 완숙되기 전에 , MU2, MU3와 WT 변화는 중첩되고, 네 가지 유전자형은 한 점으로 나뉘었다. (그림 6)

본 Workflow는 품종과 관련된 Metabolic Difference와 개발에 관한 연구이며, 토마토의 과실기에 관한 완숙과 토마토 품종의 상이함뿐 만 아니라 토마토 과일의 품종 개발 단계를 구별하는 것에 있다. 이 결과는 Hybrid System으로 Metabolite Profiling과 Identification 실험을 했다. 이 전략은 LC-MS로 식물에서 추출한 Metabolite를 검출하고 확인하는데 성공적으로 활용되었다. Processing 소프트웨어에서의 Background Subtraction은 9 Blanks, 44 QC 샘플, 10 토마토 과피 혼합물과 156 샘플(13 발육 과정에서의 4 토마토 품종)에서 세 번씩 반복 했고, 319의 가능성 있는 Metabolites를 발견했다.
이와 같이, LTQ Orbitrap Velos Hybrid Mass Spectrometer는 서로 다른 토마토 품종사이에서 신진대사의 뚜렷한 차이를 쉽게 밝혀냈으며 아울러, 고감도 고분해능의 High Accuracy Mass 데이터를 제공할 수 있는 유일무이한 장비이다. 활용 분야로는 Plant, Environmental, Urine, Plasma등 복잡한 샘플 속에서 미량 존재하는 Metabolites를 Profiling하고 Identification하기에 가장 적합한 장비이다.