Fluorescence Spectrophotometer, Peltier Accessory, Intrinsic Fluorescence, Tryptophan, Right Angle Light Scattering, Proteins

생물학적으로 단백질의 3차원적 구조는 상당히 복잡해서, 구조적 안정성에 의해 크기부터 생물학적 활성도까지 결정된다(그림 1).¹ 더욱이 3차원 구조에서는 단백질의 특정 아미노산에서의 탈아미드화, 가수분해, 산화, 이성화와 이황화물 혼합화 또는 당화반응과 같은 화학적 변화는 생물학적 활성에 매우 큰 영향을 줄 수 있다. 따라서 단백질의 안정성 조사와 선별은 상당히 중요하고 의미 있는 연구이다.

그림 1. BSA 단백질의 3차원 구조

용액 상태의 단백질 안정성은 융해 온도 (Melting Temperature)와 같은 매개변수로 그 안정도를 나타내는데, 열량측정법, 형광 분광법, 적외선 분광법, 원이색법등의 다양한 측정법이 사용되고 있다.² 이런 측정법들은 단백질 용액에 열을 가하여 온도에 따른 변화를 관찰하는 방식으로 안정성의 열적인 부분만 고려된다는 의미에서 열적안정성 (thermostability) 이라고 명명한다.³

단백질은 20 종류의 아미노산으로 구성되어 있는데, 이 아미노산 중 Tryptophan, Tyrosine, Phenylalanine은 형광이 검출된다 (그림 2).⁴ 형광분광법은 이런 형광 아미노산에 의해 검출되는 단백질의 고유 형광 (Intrinsic Fluorescence)을 주로 분석하는데, 다른 분석법들에 비해 미량의 시료에서도 충분히 측정 가능한 장점이 있다. 형광이 충분히 나오지 않는 단백질에는 형광 시약을 결합시켜 형광을 확인하는 외부 형광 (Extrinsic Fluorescence) 측정법도 있다.

그림 2. 형광 아미노산 3종의 분자구조

최근에는 형광 측정이 어려운 단백질 용액의 열적 안정성 측정을 위해, 온도에 따른 단백질의 구조변화를 직각산란광 (Right Angle Light Scattering, RALS)으로 확인하는 연구도 진행되고 있다. 직각산랑광을 이용한 분석법에서는 형광 측정 파장을 여기 파장과 동일하게 설정하고 온도를 올리면서 단백질이 응고 됨에 따라 산란광이 급격히 증가되는 현상을 관찰하게 된다.⁵

온도에 따른 단백질의 형광과 직각산란광 변화를 측정하기 위해 ㈜ 신코에서 개발된 Peltier 시스템 (그림 4)으로 실험을 수행하였다. Peltier 시스템은 -10도에서 100도까지 빠르고 정밀하게 온도를 제어할 수 있다. 이 악세사리 시스템은 온도 제어 뿐만 아니라, magnetic stirrer을 이용한 시료 교반 기능과 성에 제거 기능도 제공한다.

본 연구에서는 형광 분광 광도계 (FS-2)와 Peltier 시스템을 사용하여 단백질들의 온도에 따른 고유형광과 직각산란광을 측정하고, 열적안정성을 비교해보았다.

그림 4. Peltier System Accessory (Single Cell Holder (a),
4-Position Cell Holder (b), Peltier Control Module (c) )