UV Quantitation of Dextrophan and 3-Methoxymorphinan
생체 밖에서 배양된 샘플에서의 Dextrophan과 3-Methoxymorphinan의 농도는 샘플을 세 번씩 반복 주입하는 것과 Dextromethorphan 농도에 따른 UV 검량 표준 곡선으로 정량분석을 실행했다. 그 결과 Dextrophan은 1,852ng/ml, 3-Methoxymorphinan은 1,484ng/ml으로 확인할 수 있었다.

Mass Spectrometer Quantitation-Flexibility in Selecting Transitions
혼합물에서의 대사산물에 대한 정확한 정량분석은 Full Scan MS/MS를 통해서 할 수 있다. 본 연구에서 사용한 Velos ProTM 이중 직선형 이온트랩(Dual-Pressure Linear Ion Trap)은 HCD와 CID Fragmentation Mechanism을 둘 다 구현할 수 있어 다양한 방법으로 보다 좋은 결과를 제공할 수 있다. Figure5는 Dextrophan의 CID의 최적화된 Fragmentation과 HCD Fragmentation Pattern을 비교했다. CID 스펙트럼에서 가장 감도가 좋은 Peak는 HCD 스펙트럼으로부터 얻은 가장 감도 좋은 Peak보다 두 배 이상 좋았다. 그 결과, CID는 Dextrophan을 정량 분석하는데 선택하였다. 3-Methoxymorphinan은 HCD를 이용할 경우, Unique Fragment를 검출할 수 있어서 HCD로 정량분석을 했다. HCD와 CID Fragmentation Spectra는 동일한 Run에서 획득되었기 때문에, 정량에 사용한 Fragment Ion이나 정량 하고자 하는 Transition의 선택은 결과를 Review하는 과정에서 선택되어지고, 어떠한 시료의 재주입이나 실험이 요구되어지지 않는다.

Figure 5. Fragmentation spectra of dextrorphan using CID and HCD

Mass Spectrometer Quantitation-Plasma Samples
생체 밖에서 Microsomes배양의 정량은 플라즈마 안에 있는 Dextrophan과 3-Methoxymorphinan의 잇따른 정량분석을 위해 표준 물질로 사용되었다. 18 Points의 검량 표준 곡선은 Dextrophan의 경우 0.137에서 1852ng/ml, 3-Methoxymorphinan는 0.110에서 1484ng/ml 범위로 Quenched Microsomal Matrix와 함께 농도 별로 희석하여 준비하였다.
LC-MS 샘플의 Matrix는 분석물질의 Peak 감도에 눈에 띄게 영향을 줄 수 있고, 표준시료는 Blank Plasma Extract와 1:1로 혼합해서 모든 샘플은 동일한 Matrix를 가지게 했다. 12개의 농도별 혈장 샘플은 2에서 500ng/ml(Dextrophan)과 2.5에서 800ng/ml(3-Methoxymorphinan)의 농도 범위로 제조하였다. 이러한 샘플은 Microsomal Blank Matrix와 CAN 침전에 의해 준비되었다. 검량 표준 곡선은 동일한 매트릭스 조건에서 분석하기 위해 플라즈마 상청액에 Blank Microsomal Matrix을 1:1로 혼합해서 실험했다.

Quantitative Results for Dextrophan and 3-Methoxymorphinan
검량 표준곡선의 한 예로 Figure6에서 Dextrophan을 보여준다. ±20%이상 차이 나는 것은 배제시키고, 검량 곡선에 사용된 Dextrophan과 3-Methoxymorphinan 포인트는 가장 간단한 소프트웨어 기능을 적용하여 검량 표준 곡선을 작성하였다. 스파이크된 플라즈마 샘플은 동일한 매트릭스에서 농도별로 검량 표준 곡선을 만들고 정량 분석하였다. 12개의 샘플은 2번 반복 실험하였으며, Table 2에 평균결과를 정리하였다. Dextrophan 정량에 있어 9번 샘플과 12번 샘플을 제외하고는 모두 실제 값의 20% 범위 내에서 측정되었다.

Figure 6. Quantitation of dextrorphan by SRM (258 →201, CID)

Table 2. Quantitation results for spiked plasma samples quantified by MS based on standards prepared by UV-MS correlation

1All values are n=2, except sample #7 where only
one data point was available.

Dextrorphan의 Desmethyl Metabolite의 정량 분석은 UV-MS를 거쳐 Velos Pro^TM 이중 직선형 이온 트랩에서 다중 Fragmentation 모드를 이용하여 LC-MS 검량 표준 곡선과 함께 이중 플라즈마 Microsomal Matrix에 더하여 성공적으로 달성하였다. 이 방법은 ±20%범위에서 2개의 시료를 제외하고는 대부분 샘플이 허용되는 정확도를 제공하였다.