생체 내 대사산물의 양적인 평가는 규정단체(MIST와 M3 R2)에서 발표하는 지침과 그들의 잇따른 분석법 및 수단과 함께 그 연구 영역이 다양하게 확장되어 오고 있다. 생체 내에서 대사산물 확인을 하는데 어려운 점은 관련된 대사산물의 절대적인 구조를 알 수 없고 관련된 표준물질을 얻기가 어려울 경우 획득된 양적인 평가를 하기가 어렵다는 점이다. 매트릭스의 억제에 관한 과제, 분석물질의 안정성과 질량분석 검출기에 대한 반응 인자는 Parent Drug 표준물질을 기준으로는 거의 불가능 했던 대사산물의 정량분석을 가능케 만들었다. 우리는 시험관 내에서 발현된 샘플로부터 대사산물의 농도를 할당하기 위해 UV와 상관관계가 있는 것을 적용시켰고, 질량분석기를 이용한 동일한 분석 조건에서 혈장 샘플에서의 대사산물의 양을 비교하여 결과를 사용했다.

혈장 내 Deamethyl 대사산물과 Dextro-Methorphan을 정량분석하기 위해 UV-MS를 이용하여 시험관 내에서 만들어 낸 표준 곡선을 통해서 상관관계를 입증했다.

Sample Preparation
질량분석기로 대사산물의 표준을 만들기 위해, Dextromethorphan(50uM)을 Human Liver Microsomes(HNM, 1mg/ml)에서 1시간 배양했다. Blank Microsomal Matrix는 이차 표준 물질을 만드는 데 사용된 희석액과 유사한 것으로 준비했다. Dextrophan과 3-Methoxymorphinan의 농도는 억제된 Microsomal Matrix에서 준비한 Dextromethophan의 UV(280nm)에 해당하는 표준곡선으로 결정했다. Microsomes 배양은 억제된 Microsomal Matrix를 이용한 표준곡선을 제공하기 위해 희석했다. 12개의 플라즈마 샘플은 Dextrophan과 3-Methoxymorphinan를 농도를 달리 첨가하여 만들었으며, ACN으로 침전시켜 준비했다. Matrix Effect를 줄이기 위해, Blank Matrix와 1:1로 섞었다.

Liquid Chromatography
배양된 혼합물을 처음으로 분석할 때, 대사산물의 확인과 UV-MS를 이용한 정량분석 둘 다 Thermo사의 Accela LC 시스템과 Velos Pro^TM 이중직선형 이온트랩을 사용하였다. 분리는 역상컬럼을 이용하여 Table 1의 LC Method로 실험했다. 질량분석기를 이용한 검량 표준 곡선의 분석과 플라즈마 샘플은 동일한 분석장비와 함께 LC Method B 조건으로 Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ Column(100x2.1mm, 1.9um)를 이용하여 분리했다.

Mass Spectrometry
모든 정량분석과 정성분석은 Heated Electrospray Ionization(HESI-II) Probe가 장착된 Velos Pro^TM 이중직선형이온트랩 (Dual-Pressure Linear Ion Trap)으로 실행했다.

Mass Spectrometry
대사산물 검출과 구조 해석은 Thermo사 Mass Frontier 7.0 소프트웨어로 분석했고, 정량분석은 Thermo사 Xcalibur 2.1소프트웨어를 이용하여 결과를 도출했다.