| 1. |
Fluorescence Spectrometer (FS-2) |
| 2. |
Luminescence Microcell Holder |
| 3. |
PBS Buffer Solution 0.1M (pH 7.4) |
| 4. |
Luc8 150μM
(한양대학교 생명과학과 김영필 교수님께서 제공) |
| 5. |
Quantum Dot 605, 655, 705, 800 8μM
(Invitrogen) |
| 6. |
Coelenterazine H 1μg/μl in methanol (Promega) |
| 7. |
NiCl2 100μM in distilled water (Sigma Aldrich) |
| 8. |
10μl Eppendorf Tubes |
| 9. |
45μl Fluorescence Microcell |
| 10. |
Pipette & Pipette Tip |
| 11. |
Vortex Mixer |
| 1. |
10μl Eppendorf tube를 4개에 준비한다. |
| 2. |
각각의 tube에 PBS buffer를 94μl, donor인 Luc8을 1μl씩 넣는다. |
| 3. |
Acceptor인 Quantum Dot 605, 655, 705, 800을 tube마다 각각 5μl씩 넣는다. |
| 4. |
Donor와 acceptor의 결합촉진제인 NiCl2 용액을 모든 tube에 2μl씩 넣고 vortex mixer를 이용하여 충분히
혼합시켜준다. |
| 5. |
FS-2에 Luminescence Microcell Holder를 설치한 후, 시료를 마이크로 셀에 주입하고, 마이크로 셀을 셀
홀더에 넣는다 |
| 6. |
FluoroMaster Plus Software의 Wave Scan을 실행 시킨 후, 설정 값을 입력하고 Apply 버튼을 눌러 설정 값의
상태로 장비를 대기시킨다 (그림 7). |
| 7. |
Pipette을 이용하여 coelenterazine H를 2μl 넣어주고, 주입과 동시에 cell compartment의 덮개를 닫고
Start 버튼을 눌러 각각의 시료에 대해서 스펙트럼을 측정한다. |
| 8. |
측정한 Data들에 Baseline Correction을 해준다. 화면 상단에 있는 Baseline Correction 아이콘을 선택한
후, 제일 낮은 형광 세기가 나온 파장을 기준으로 Baseline을 보정한다 (그림 8). |
| 9. |
보정한 Data들을 Luc8을 기준으로 표준화하여 Quantum Dot의 데이터들을 비교한다. 모든 스펙트럼들의 Luc8의 peak 값이 일치되도록 환산 값을 계산 한 후, 화면 상단에 있는 Scalar Calculator 아이콘을 선택하여 환산 값을
곱해 표준화시켜 데이터를 비교한다 (그림 9). |
그림 7. Wave Scan 측정 조건
그림 8. Baseline Correction 화면
그림 9. Scalar Calculation 화면
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