열을 가하기 전에는 형광 프로브간의 거리가 짧아 donor에서 acceptor로 에너지가 전이되는 FRET 현상이 일어난다. 따라서 donor의 흡광 파장 519nm에서는 형광이 약하게 방출되고 acceptor의 흡광 파장 553nm에서 형광 세기가 강해진다.² 하지만 열에 의해 thermal denaturation이 일어나면 에너지 전이가 일어나지 않아 519nm에서 형광이 강해지고, 553nm에서는 형광이 약하게 방출된다.³ (그림 4)

그림 4. Thermal Denaturation
이전(좌측, 25℃)과 이후(우측, 55℃)의 형광 세기 변화

Thermal mode를 이용하여 측정한 donor, acceptor 의 형광값 변화는 그림 5와 같다. FRET 현상이 없어지며 생기는 Donor와 Acceptor의 형광 값 역전 현상을 확인 할 수 있다.

그림 5. 온도에 따른 Donor 시료와 acceptor 시료의 형광 변화

다음으로 oligonucleotide의 TM 값을 구하였다. 온도 변화가 확실한 donor 데이터를 기준으로, 소프트웨어를 사용하여 각 온도에서의 형광 변화 기울기를 구하였다. TM 값을 구하는 방법은 몇 가지가 있지만, 그림 6과 같이 형광 변화 기울기 그래프는 peak 값을 갖기 때문에 peak 값을 TM으로 잡는 방법을 일반적으로 사용한다. 실험을 위해 제작한 oligonucleotide의 TM 값은 49℃임을 확인 할 수 있다.

그림 6. 온도에 따른 형광 기울기 변화와 TM 값

본 실험에서는 ㈜신코의 형광 분광광도계 FS-2와 Peltier System 액세서리를 이용하여 온도에 따른 oligonucleotide의 형광 세기 변화 추이에 대하여 살펴보았다. 또한 결합상태에 따른 물질의 안정성을 나타내는 융해 온도 (TM)를 실험을 통해 구할 수 있음을 확인 하였다.

1. Frank H Niesen, et al., Nature Protocols, 2, 2212 (2007).
2. Scinco, Application Note, FS2-AN002 (2011).
3. Brian A Pollok, Rogger Heim, Trend in cell biology, 9, 57 (1999).