Fluorescence Spectrometer, Thermal Denaturation,
Oligonucleotide, Melting Temperature, Forster Resonance Energy Transfer (FRET)

생화학 분야에서의 생체 물질의 열 특성은 물질 분석에 중요한 단서이면서, 실험 과정 설계 시 실험의 실패를 줄이기 위해 중요하게 고려해야 할 요소이다. 이런 생체 물질의 열 특성들 중에서 가장 널리 사용되는 것은 융해 온도 (T_M)이다.¹

많은 화학 결합으로 이루어진 생체 물질에 열을 가하면, 물질의 내부 에너지가 올라가 화학 결합이 끊긴다. 이렇게 화학 결합이 끊기게 되면 물질의 구조 변화를 일으키는데 이런 열 변성을 thermal denaturation이라 하고, 가장 활발하게 denaturation을 일으키는 온도를 융해 온도라 한다. 융해 온도는 물질의 결합상태에 따른 안정성을 나타내는 지표로 사용되며, PCR을 비롯한 많은 생화학 실험법에 응용된다.

유전물질 oligonucleotide는 수 개에서 수십 개의 염기로 이루어진 짧은 유전체를 말한다. ligonucleotide는 임의의 염기 서열로 합성 할 수 있는데, DNA 염기 서열 확인, PCR, DNA, RNA 구조 해석 및 유전자 발현 해석 등 다양한 분야에서 사용되고 있다.

본 실험에서는 그림 1과 같이 10개의 상보적 염기서열을 가진 oligonucleotide에 한 쪽 5’end에는 형광 표지자 Alexa Fluor^® 488을 붙이고, 다른 하나의 5’end에는 형광 표지자 Alexa Fluor^® 532를 붙였다.

그림 1. Thermal Denaturation 의 도식

온도에 따른 시료의 형광 변화를 측정하기 위해 ㈜ 신코에서 개발된 Peltier 시스템 (그림 2)으로 실험을 수행하였다. Peltier 시스템은 -10도에서 100도까지 빠르고 정밀하게 온도를 제어할 수 있다. 이 악새서리 시스템은 온도 제어 뿐만 아니라, magnetic stirrer을 이용한 시료 교반 기능과 성에 제거 기능도 제공한다.

본 연구에서는 형광 분광 광도계 (FS-2)와 Pltier 시스템을 사용하여 형광 표지자가 결합된 oligonucleotide의 온도에 따른 형광 변화 추이를 살펴보고, 그 값을 기반으로 TM 값을 구하였다.

그림 2. Peltier System Accessory (Single Cell Holder (a),
4-Position Cell Holder (b), Peltier Control Module (c) )