㈜신코는자사가 개발 생산하는 형광 분광분석장비(FS-2, Fluorescence Spectrophotometer) 의 원리와 응용 분야의 전반적인 이해를 돕고자 형광분광 분석과 관련된 칼럼을 연재 하고 있습니다.이번 일곱 번째 칼럼은 저번 호의 “형광분석을 위해 사용되는 형광 물질”에 이어서“형광분석에서 사용되는 방법 중 하나인“시간 분해능 측정법(Time-Resolved measurement)_첫 번째”에 대해 살펴 보도록 하겠습니다.

시간 분해능 (Time-Resolved measurement)은 형광 분석에서 널리 사용되고 있는 측정법 중 하나이다. 이 분석법을 사용함으로써, 기존의 단순히 방출파장을 위치를 측정하는 형광측정법(Steady-state)보다 많은 정보를 시료로부터얻을 수 있다. 예를 들어 단백질에 포함된 두 종류의다른 트립토판(tryptophan)잔기들은 기존의 형광측정법에서는 서로가 방출 파장이 근접하고 있기 때문에 개별 식별하기가 어렵지만, 각각의 트립토판의시간에 따른 형광수명(Fluorescence life time)을 측정 할 수 있는 시간 분해능 분석법을 사용하면 두 트립토판의 식별이 가능해 진다. 이러한 장점으로 인해 시간 분해능 (Time-Resolved measurement) 형광 분석법은 현재 생물거대분자(Biological macromolecules)와 세포 이미지(Cellular image)을 연구하는데 폭넓게사용 되고 있다.

[그림 1] Pulse or time-domain lifetime measurement_(위)와 단광자계수법(TCSPS)로 측정한 indole(In), anthranilic acid(AA), 2-aminopurine(AP)_(아래)
(Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd Ed., Joseph R.Lakowicz 에서 발췌함)

최근에는 단광자계수법(Time-correlated single-photon counting, TCSPC)을 사용한 장비가정밀한 시간 분해능형광법을 위해 널리 이용 되고 있다. 단광자 계수법의기기 구성은 보통 분광기기와 비슷하게 크게 광원, 전자부, 검출기 부분으로 구분되어 있지만, 각 부분을 세부적으로 살펴 보면 다른 분광기기보다 다소복잡하고 가격이 높은구성품으로되어 있음을 알 수 있다.

[그림 2] TCSPC(Time-correlated single photon counting) 장비

TCSPC의 원리를 간략 하게 살펴 보면 다음과 같다.
TCSPC의 신호에 대한 원리는아래 그림 3와 같이 도식된다. 펄스화된 광원으로부터 여기(Excitation)된 시료의 방출(emission)의 전체 스펙트럼은 맨 위 파형과 같이 보여지며, 이러한 파형은 많은 형광체(Fluorophores)들이 광원으로부터 여기 되어, 수많은 광자들이 방출되어 만들어 진다. 그러나 한번에 무작위 하게 방출되는 많은 광자를 동시에 시간 별로 정확히 측정이 불가능 하기 때문에, 단광자계수법이사용된다. 여기서는많은 기기적 조건들이 광원의 펄스약100개당 한 개 이하의 광자만 측정되게끔조절 된다.측정 시간은 여기된 펄스와 시료에서 방출로부터 관측된 광자사이의 시간을 의미하는데,이 시간들은 그림 3의 맨 아래처럼 막대그래프 형태(Histogram)로 계수화 된다.
이 그래프에서는 X축은 시간에 대한 차이이고, Y축은 이 시간의 차이 별로 관측된 광자수의 차이를 나타낸다.

[그림 3] Principle of TCSPC
(Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd Ed., Joseph R.Lakowicz 에서 발췌함)

TCSPC에서는 이러한 측정이 가능케 하기 위해 여러 가지 전자 기기들이 조합된다.
조합된 단광자 계수법의 전자 부분을 살펴 보면 아래 그림 4와 같이 이루어 진다.

[그림 4] Electronic schematic for TCSPC
(Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd Ed., Joseph R.Lakowicz 에서 발췌함)

첫 번째 검출기에서는 측정된 신호는 펄스의 도착시간을 정밀하게 측정하는 CFD(Constant Function Discriminator)란 장비를 통해 TAC(Time-to-time Amplitude Converter)란 장비로 전송된다. TAC는 시간에 따른 직선적인 전압 기울기 신호를 발생하는 장비로 나노초 시간 단위로 실행 된다. 첫 번째 CFD를 통한 신호는 TAC에서 시작점 신호로 사용된다.
두 번째 검출기에서 하나의 광자로부터 측정된 펄스가 검출되고, 신호의 도착시간은 두 번째 CFD를 통해 정밀하게 결정된다, 이 신호는 TAC에서 전압 기울기에서 정지점 신호로 사용되며, TAC에서는 여기신호와 방출신호간의 지연시간에 비례된 전압을 얻게 된다. TAC의 필요한 시간에 대한 전압부분은 연산된 이득 증폭기(PGA, programmable gain amplifier)를 통하여 증폭이 된 다음. 아날로그 신호를 디지털 신호로 전환해 주는 ADC (Analog to Digital Converter)를 통해 수치화된 값으로 만들어 진다. WD(Window Discriminator)는 TAC에서 들어온 전압값이 PGA에서 설정한 범위를 범위보다 높은지 낮은지를 비교한 다음, 범위를 만족하는 부분만을 TAC쪽에 다시 알려 주는 역할을 한다. 마지막으로 전압으로부터 전환된 디지털 신호는 측정 지연 시간에 대한 한 개의 사건(event)으로 저장되고, 펄스광원으로부터 반복적으로 수없이 측정된 한 개의 사건들이 모여 결국 점점 쇠퇴되는 막대그래프 모양을 만들게 된다.

그럼 다음 칼럼 “시간 분해능 측정법(Time-Resolved measurement)_두 번째 에서는 TCSPC의 구성품과 응용에 대해 더 살펴 보도록 하자”