MSn Glycan Spectra에 대한 자동적인 구조 해석은Figure 1에서 보듯이, Chicken Ovalbumin으로부터 해리된 Glycan으로 시험해 보았다. 시험해 본 결과에서 볼 수 있듯이, 그리고 58th ASMS에서 발표된 Glycome Technologies와 비교하여 보아도 Glycans에 대한 연구는 Depth 즉 MS/MS/MS 또는 MS/MS/MS/MS를 수행하여야 하기에 LTQ Velos Pro와 SimGlycan 소프트웨어를 이용한 Glycans 연구는 현재 가장 이상적인 System Tool이라고 할 수 있다.


[Figure 1.] Workflow for automated structural interpretation of
MSn glycan spectra.                             

Figure 2a는LTQ Velos Pro로 분석하고 Ovalbumin으로부터 유도된 Permethylate의 MS Profile을 보여준다. LTQ Velos Pro의 Dual-Pressure Ion Trap과 S-Lens Ion Optics은 Trapping과 Fragmentation 효율에 있어 월등히 개선되었기에 MSn 수행에 있어서도 월등히 정확한 결과를 얻을 수 있기에 Glycans 연구에 있어 이상적인 질량분석기이다. Figure 2b는 m/z 1054.68(+2)

의 MS2 스펙트럼을 보여준다. 전체 Glycan 구성을 만드는 다른 Monosaccharide 들을 규명하는 것은 가능하지만 일반적으로 MS2 스펙트럼으로부터 linkage되고 branching 된것을 결정하는 것은 어렵다. Glycan의 구조를 전부 특성화하기서는 이 Precursor에 대해 연속적인 MSn 스펙트라를 얻도록 셋팅한다. 그리고 data 해석을 위해서 SimGlycan Software를 사용한다. LTQ Velos Pro는 모든 MS 실험에 대해 “Enhanced Scan” profile mode로 수행한다. Enhanced Scan mode는 Higher Resolution을 제공하고 Precursor와 Fragmentation Ion에 대해 Charge-stage를 결정한다. 결과 분석에서 초기 스텝은 자동으로 구성성분을 규명하기위해 SimGlycan 에 MS2 스펙트럼을 삽입해야 한다. 기본적으로 SimGlycan 은 MS2 data를 match하여 서치한다. 만약 MS2 스펙트럼에 대해 엄격한 규칙으로 다루었다면, SimGlycan database 서치결과에서 상위순위의 Glycan으로, 두개로 갈라지는 GlcNAc 구조를 가지고m/z 1054.68(+2)에 대해 MS/MS Fragmentation Pattern을 Figure 3과 같이 Hybrid Glycan으로 해석할 수 있다. 제출한MS2 스펙트럼들은 SimGlycan software에 의해 리포트된 Glycan List들을 검증하면 매우 낮은 순위를 가지지만 같은 Mass를 가진 추가적인 Glycan 구성을 추가적으로 보여준다. Figure 2b에서 볼 수 있듯이 제출한MS2 스펙트럼과Matching것은 낮은 가능성을 가지는 것으로 리포트된 낮은 순위에 해당하는 것으로 Glycan들이 추가적인 Isomer들로 존재한다는 것을 알 수 있다. 모두가 Assign된 스펙트라에서도 Figure 2b와 같이 주된 Fragmentation이 아닌 것도 있다.


[Figure 2.] (a) Ion trap (IT) mass spectrum of permethylated ovalbumin released glycans (labeled peaks correspond to Table 3). (a) Ion trap (IT) mass spectrum of permethylated ovalbumin released glycans (labeled peaks correspond to Table 3). (b) IT MS/MS spectrum of the peak at m/z 1054.68. (c) Set of sequential MSn spectra acquired for peak at m/z 1054.68 (+2).


[Figure 3.] SimGlycan search results for ion trap MS/MS spectrum of precursor ion at m/z 1054.68 (+2). Symbolic representation of top-ranked and two lower-ranked glycans search results by SimGlycan software is shown.

추가적인 Isomer가 존재하는 샘플에서 Glycan들을 규명하는 것은 SimGlycan Software를 통해 MSn Fragmentation Pathway와 Matching된 낮은 순위의 Glycan 구조들을 확인하는데도 사용한다. Software에 형성된 리스트로부터MSn Fragmentation Pathway를 비교하기 위해 하나의 특별한 구조를 선택한 후, 각 선별된 Fragmentation 들은MSn 스펙트럼에서 선택한Precursor와 Matching 시켜본다.
추정된 리스트로부터 Isomer를 확인하거나 제거하기위해 Asialyl Digalactosyl Biantennary Glycan를 선택했다. 이것은 상위순위로 Matching 되는 것으로 같은 Precursor Mass를 가지지만 MS2 결과를 기반으로 확인할때는 Figure 3의 리스트중 순위 14와 같이 순위가 매우 낮아진다. Figure 2b와 같이 m/z 1054.68(+2)의 MS2 스펙트럼으로부터 더 많은 Fragmentation을 위해 m/z 1623.25(+1)에서 Fragmentation Ion을 선택했다. 이 이온의 검출은 Asialyl Digalactosyl Biantennary Glycan의 환원하지되지 않은 말단기로부터 Gal-GlcNAc의 Loss를 가리킨다. Figure 2c와 4a는 선택한 구조의 이론적인 Fragmentation과 실질적인 스펙트럼의 Fragmentation match와 이 이온들을 위한 MS3 스펙트럼을 보여준다. MS3 스펙트럼에서 가장 흥미있는 것은Gal-GlcNAc 구조의 추가적인 Loss에 상응하는 m/z 1159.93(+1)에서 Fragmentation Ion 이다. 추가적인 Loss는 환원되지 않는 말단기에서 가능하며 이것은 오직 본 연구자들이 선택한 Asialyl Digalactosyl Biantennary Glycan에서만 가능하다.

Figure 4b는 제안된 구조를 위한 전반적인 Sequential Fragmentation Pathway를 보여준다. 아울러, 이것은 Figure 2c (1054.68 g 662.50)에서 얻은 연속적인 MSn 스펙트라의 구성과 선택한 구조에서 모두 양립할 수 있는 것이다. Figure 4c는 Bisecting GlcNAc에서 Hybrid Glycan을 위한 Fragmentation Pathway(Figure 2c에서 1054.68 g 1070.84)를 보여준다. 이것은 더 나아가 m/z 1054.68(+2)에서 Precursor로 존재하는 것임을 확인해 준다. 추가적인 Hybrid Glycan은 Figure 4d (Figure 1c에서 1054.68 g 621.59)에서 이 Precursor에 대한 규명을 볼 수 있다. Figure 4b-d에서 설명한 대로, SimGlycan Software는 Isobaric Oligosaccharides를 해석할 수 있고, 선택한 구조에 있어 자세한 특성을 알아갈 수 있다.


[Figure 4.] (a) Ion trap MS3 spectrum of precursor at m/z 1623.25 (+1). Symbolic representation of Y-type glycosidic fragments are shown.
MSn fragmentation pathway for (b) (Gal)2(Man)3(GlcNAc)4 (c) (Man)5(GlcNAc)4 and (d) (Gal)(Man)4(GlcNAc)4.

[Table 3.] Structures of chicken ovalbumin N-linked released glycans
    identified in this study (structures drawn using GlycoWorkbench16)

Table 3은 위에서 설명한 접근법을 사용하여 SimGlycan Software에 의해 규명된 2개의 다른 구조의 Glycan Isomer (5번과 9번으로 표기된 것) 들을 보여준다. 게다가 다른 구조적인 Isomers들은 MS2에서 불충분하게 Fragmentation이 형성되었을 때, MS3에서 신뢰할 수 있는 정확한 Glycan 구조를 설명하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, m/z 1422.92(+2) 피크는 하나의 Glycan 구조를 나타낸다. 하지만, MS2 스펙트럼은 정확한 구조를 설명할 수 있는 충분한 정보를 제공하지 못하다. 사실 SimGlycan에 MS2 data를 넣으면 Key Fragmentation Ion이 없어서 1 순위로 존재하는 부정확한 구조를 결과로 도출해 낸다. 이 Precursor의 정확한 구조는 Table 3 (19번으로 표기된 것)에 정리했다. Figure 5에서 MS3 Sequential Fragmentation Pathway에서 Highlight부분은 Glycan 규명에 있어 반드시 요구되어지는 부분이며, SimGlycan은 MS3 스펙트라를 해석하기위해 사용이 요구되어진다.


[Figure 5.] Ion trap MSn fragmentation pathway for precursor at m/z 1422.92 (+2).

bullet Permethylation을 시킨 후, MSn 과 SimGlycan Software의 사용은 Glycan들이 해리된 Chicken Ovalbumin의 다양한 구조적 Isomers 구별과 성공적인 규명을 가능케 한다.
bullet 자동화된 High-throughput Data Analysis를 통해 전반적으로 분석 시간이 많이 감소되었다.
bullet Glycan을 분석하고 그 주조를 해석하는데 있어 SimGlycan Software는 Thermo Scientific Ion Trap MS 또는 Ion Trap/Orbitrap Hybrid MS로 실행하여 획득한 MSn 실험 결과들을 간단하게 분석/처리할 수 있다.