㈜신코는 자사가 개발 생산하는 형광분광 광도계(FS-2, Fluorescence Spectroscopy)의 원리와 응용에 대한 이해를 돕고자 형광 분광 분석과 관련된 칼럼을 연재 하고 있습니다. 그 두 번째 칼럼으로 “형광분광광도계의 측정원리와 응용분야”에 대해 살펴 보도록 하겠습니다.

형광은 분자가 높은 에너지의 짧은 파장의 빛을 흡수해서, 그보다 긴 파장의 빛을 방출하면서 발광하는 현상입니다. 분자가 빛을 흡수하면 분자는 보다 높은 에너지의 들뜬 상태로 올라가게 됩니다. 빛을 흡수한 분자가 들뜬 상태로 올라가면 불안정하게 되어, 에너지를 열의 형태로 방출하거나 다른 파장의 빛을 방출하면서 원래 상태로 떨어지게 됩니다.

[그림 1. 형광의 기본 메커니즘]

분자의 종류에 따라 흡수하고 방출되는 빛의 에너지와 파장이 다르기에, 각각의 형광 물질들은 그림 2와 같이 다양한 형광색을 보이게 됩니다.

[그림 2. 다양한 형광을 내는 형광 물질들]

일반적으로 형광분광광도계는 UV-Vis 분광광도계와 많이 비교가 됩니다. 두 분광계는 자외선에서 가시광선 범위의 파장(190-900 nm) 빛을 물질에 쪼여, 물질이 특정 파장 영역의 빛을 흡수하게 한다는 공통점이 있습니다. 차이점은 그림 3과 같이 UV-Vis 분광광도계는 물질에 흡수되지 않은 복사선을 측정하여 어느 파장에서 어느 정도의 빛이 흡수하는지를 확인하는 반면에, 형광분광광도계는 물질에서 방출되는 형광을 측정하여 어느 파장에서 얼마나 센 형광이 나오는지 확인합니다. ㈜신코에서는 형광분광광도계와 (Flour Mate FS-2, 그림 4) UV-Vis 분광광도계 (S-3100, Nesosys-2000 등, 그림 5) 모두 생산하고 있습니다.

[그림 3. 형광분광광도계와 UV-Vis 분광광도계의 구동 원리 비교]

[그림 4. 형광분광계 FS-2]              [그림 5. UV-Vis 분광계 S-3100]

형광분광분석법은 UV-Vis 분광분석법보다 감도와 검출 한계가 훨씬 더 좋은 특징을 가집니다. 비유를 들자면 환한 공간에서 100 명이 각자 촛불을 들고 있다가 1명이 촛불을 껐다고 하면 별다른 차이를 느끼지 못하지만, 어두운 곳에서 1명이 촛불을 켰다고 가정하면 그 빛을 선명하게 볼 수 있습니다. 처음의 예는 UV-Vis 분광분석법의 예로서 배경이 너무 밝기 때문에 작은 흡광도를 측정하기 매우 어렵지만, 두 번째 예는 형광분광분석법의 예로서 어두운 배경으로부터 형광은 매우 높은 감도로 검출이 가능합니다.

형광분광광도계의 측정은 여러 단계를 거칩니다. 첫 단계로 빛을 쪼여줘 어느 흡광 파장에서 빛을 가장 많이 흡수하는지를 측정합니다. 다음으로 측정된 흡광 파장에서 얼마나 많은 형광이 방출되는지 확인하기 위하여, 흡광 파장을 고정시키고 형광 파장을 변화시켜가며 측정 합니다. 이 과정에서 얻는 스펙트럼을 형광 스펙트럼이라 합니다. 마지막으로 형광 스펙트럼에서 형광이 최대로 나오는 형광 파장을 고정시키고, 흡광 파장을 변화시켜가며 측정하여 흡광 스펙트럼을 얻게 됩니다.

그림 6는 전형적인 형광분광광도계의 스펙트럼의 예로, 벤젠에 용해된 페릴렌의 흡광, 형광 스펙트럼입니다. 왼쪽 점선 스펙트럼은 흡광 (들뜸) 스펙트럼이며 오른쪽 녹색 스펙트럼은 형광 (방출) 스펙트럼입니다. 조사하는 빛의 에너지가 최소한 방출되는 에너지보다 커야 하므로, 흡광 스펙트럼은 일반적으로 형광 스펙트럼보다 단파장에서 관찰됩니다.

형광분광광도계는 형광 물질의 정량 분석과 정성 분석이 가능합니다. 이론적으로 방출되는 형광의 광도는 형광 물질의 농도와 쪼여주는 빛의 세기에 비례하기 때문에, 농도를 알고 있는 기준 물질과 미지 농도의 물질의 광도를 비교하여 정량 값을 구할 수 있습니다. 또한 형광 분석은 흡광 파장과 형광 파장의 두 가지 파장을 구할 수 있으므로, 파장의 형태를 통하여 물질의 정성 분석도 할 수 있습니다.