레드 와인은 매우 복잡한 혼합물이며, 몸에 유익한 항산화 물질이 풍부하다. 이와 같은 천연물질의 규명과 정량은 매우 중요한 과제 중 하나이다. 따라서 본 연구에서는 와인의 항산화 성분의 상대적인 정량과 동시에 성분을 검출하는데 목적을 두었으며, 프랑스산 레드 와인을 분석하기 위해 초고속 크로마토그래피(U-HPLC: Ultra High Pressure Liquid Chromatography)와 Thermo Scientific사의 고분해능 질량분석기 LTQ Orbitrap XL을 이용하였다. 아울러, 특별한 전처리 없이 진행 된 것이 본 연구의 큰 장점중의 하나이다.
이미 알려진 바와 같이 Quercetin과 같은 Phenolic compounds는 대부분 몸에 유익한 성분으로, 특별히 본 연구에서는 서로 다른 수확기에 수확한 레드 와인에서 공기 중 변하기 쉬운 성분들을 시간대 별로 확인하였다.

오랜 연구결과에 의하면, 산소분자로부터 유도된 자유라디칼은 체내에서 조직 손상을 일으키는 주된 원인이 되고 있다. 반면, 와인을 규칙적으로 적당히 마시게 되면 와인의 유익하면서 풍부하게 함유된 항산화 물질들로 인해 여러 가지로 건강에 좋은 영향을 준다고 밝혀져 있다. 특히 와인이 포함하고 있는 혼합물 가운데 Phenolic 성분들은 와인의 질에 중요한 기여를 할 뿐만 아니라 점진적 변화에 있어서도 필수적인 성분이다. 또한 Quercentin은 음식물 섭취로부터 보충되는 항산화 성분들과 함께 혈관 완화를 촉진, 생체 내 혈소판 억제제, 심장병 예방에 뛰어난 효능이 있는 것으로 입증된 바 있다.

Reversed-phase HPLC는 레드 와인 속 Flavonoid 분석과 함께 정량분석을 하기에 좋은 분석방법이다. Reversed-phase HPLC와 질량분석기를 함께 이용하게 되면 아래와 같은 유용한 점이 있다.
1) 시료의 특별한 전처리나 복잡한 분류과정 없이 혼합물을 분석할 수 있다.
2) 넓은 농도 범위 내에서 수많은 화합물을 정성분석 할 수 있다.
3) 정확한 분자량 측정으로 복잡한 화합물의 정성과 Fragmentation spectra 정보를 통한 구조적인 정보를 제공할 수 있다.

따라서, 본 연구에서는 와인이 공기에 노출된 후에 산화되는 정도에 따른 변화를 모니터 하기 위해 진보된 방법으로 초고속 크로마토그래피(U-HPLC: Ultra High Pressure Liquid Chromatography)와 Thermo Scientific사의 고분해능 질량분석기 LTQ Orbitrap XL을 사용하였으며, 특히 특정 지역에서 생산되고 있는 와인의 포도 수확 년도에 따른 변화를 정확한 통계수치로 표시하는데 목표를 둔 Workflow를 제시하였다.

샘플로는 프랑스산 레드 와인, Les Charmes de Kirwan, Margaux(cuvee, Bordeaux region, France) 2003년, 2005년 산으로 와인　전문도매상인으로부터 얻었다. 와인은 실험하는 동안 어두운 실온에서 보관하였으며, 병을 오픈 하는 즉시, 유리바이알(20ml)에 병의 상위에 있는 와인으로 가득　채우고, 산화되는 것을 최소화 시키기 위해 재빨리 뚜껑으로 닫고 어두운 4°C에 보관했다. 나머지는 와인병에서 20ml 유리 비커에 등분했다. 이 비커로부터 샘플 바이알에 와인을 즉각 채우고 4°C로 셋팅된 Thermo Scientific Accela autosampler tray에 올려 두고 실험을 수행하였다. 와인의 산화되는 경향을 분석하기 위해, 와인을 병에서 오픈 한 후 1, 5, 24시간을 경과 후에 차례로 와인을 분석하였다.
Accela U-HPLC와 Hypersil GOLD column(2.1mm x 100 mm, 1.9um particles, equilibrated in 95% solvent A (0.1% aqueous solution of formic acid), 5% solvent B (acetonitrile containing 0.1% formic acid))을 이용하여 분석하였다. 유속은 300ul/min로 했으며, linearly increasing solvent B concentration from 5% to final 40% over 15 min, and from 40% to 95% over 1 min로 하는 gradient 조건으로 실험하였다. Thermo Scientific사의 LTQ Orbitrap XL의 분해능은 30,000(FWHM @ m/z400)에서 positive ion mode로 분자량을 확인하고(Full scan, mass range 150-1500u), 앞에서 찍은 Full Scan(mass range 150-1500u, 분해능 30,000)에서 intensity가 가장　큰 이온을 자동으로 선택되게 하는 Data Dependent MS/MS 기능을 이용하여 분해능 7,500에서 Fragmentation 데이터를 얻었다. (~0.3 sec per scan) Data는 external calibration으로 세 번 반복실험 하였다. 또한 MS/MS 데이터는 HCD(Higher Energy Collision Dissociation) Fragmentation Mode로 65% Normalized Collision Energy, Isolation Width- 3u로 설정하였다. 그리고 결과 처리는 Thermo Scientific사의 SIEVE 1.2 소프트웨어를 이용하여 두 종류의 와인을 비교/분석하였다. 결과는 pValue < 0.001인 것과 같은 retention time에서 peak 높이가　최소 2배　이상의 차이를 보이는 것만으로 filtering 하였다. 이렇게 SIEVE 1.2 로 부터 얻은 결과는 SIMCA P+ 11(Umetrics, Umea, Sweden)을 함께 이용하여 통계분포를 표시하였다. 아울러, Mass FrontierTM(HighChem, Slovakia) 소프트웨어를 이용하여 관측된 Fragmentation patterns을 바탕으로 예측한 구조와 화합물을 확인하는데 이용하였다.