Phosphorylation(인산화)은 단백질의 PTM(Post-Translational Modification)에 있어 가장 중요한 수식화 중의 하나로 인식되어져 있으며, 세포안에서 조절기능을 가진 많은 단백질들과 여러 가지 형태로 결합되어 생체대사에서 중요한 역할을 하고 있다. 이러한 Phosphoprotein(인산화 단백질)은 일반적으로 세포내에서 극미량으로 발견될 뿐만 아니라, Phosphorylation에 의해 산성이 증가되어 ESI 질량분석기로의 분석을 어렵게 한다. 또한 텐덤질량분석법(MS/MS)에서 Phosphopeptide(인산화 펩티드)의 어미이온들은 일반적으로 Phosphate Group(98Da)의 Neutral Loss가 일어나면서 불충분하게 쪼개지기 때문에 그 염기서열의 확인과 Phosphorylation이 일어난 정확한 위치의 규명에는 어려움이 많다. 이러한 난제를 극복하기 위해 새롭게 도입된 Data-Dependent Neutral-Loss Scan은 MS/MS 과정으로 생성된 Neutral Loss 펩티드를 선택적/추가적 쪼개짐반응(MS/MS/MS)을 통하여 보다 정확히 확인하는 것으로, Finnigan LTQ에 접목되어 성공적인 분석결과를 보여준다. 즉, LTQ Linear Ion Trap의 증가된 이온포집량(Ion Capacity)과 포집효율(Trapping Efficiency)로 인하여, 분석속도 및 MS/MS Intensity가 향상되었을 뿐만 아니라, Phosphorylated Peptide를 자동으로 확인해 주는 MS3 Intensity가 획기적으로 증가된 것이다.


아래의 그림4.는 Neutral Loss Data Dependent 실험에 있어 Scan Event에 대한 흐름을 보여준다.
그림4.에서 보듯이 만약에 MS/MS Scan Event에서 Neutral Loss Ion을 검출했다면, 즉시 그 유효성을 검토하여 유효한 Intensity를 가진 이온에 대해서 선택적으로 MS/MS/MS Scan Event를 수행한다. 예를 들어 어미이온(Phosphopeptide)이 쪼개지면서 m/z(질량 대 전하비) 98, 49, 또는 32.7(각각 +1, +2, +3가에 해당됨)과 같은 Neutral Loss를 보여준다면 Neutral Loss가 일어난 이온들 중 Intensity가 가장 큰 것부터 차례대로 자동 MS/MS/MS를 수행한 후 데이터베이스를 통해 어미 펩티드를 확인하고 그 Phosphorylation의 위치까지도 자동으로 확인할 수 있는 것이다.


그림5.는 LTQ Capillary LC/MS/MS의 Data Dependent 기능을 사용하여, 10 fmol casein digest를 분석한 Base Peak Chromatogram과 그것의 Mass Spectrum을 보여주고 있다. Full-Scan으로 확인한 m/z 831.6 이온을 자동으로 MS/MS한 후 나온 m/z 782.1은 49만큼의 Neutral Loss를 보여주고 있기 때문에 Data Dependent Neutral Loss Algorithm을 통해 이 이온에 대하여 바로 MS/MS/MS를 수행하게 된다.

 

그림6.은 이와 같은 실험으로 확인한 Phosphopeptide 3개에 대하여 각각의 MS/MS와 MS3 Spectra를 보여준다.

 

 

 

아래의 그림7.은 BioWorks Software에서의 TurboSEQUEST 검색파라미터 및 m/z 831.6에서 찾은 Phosphorylated Peptide에 대한 검색결과이다.
Neutral Loss Ion(782.1 m/z)은 H1PO4가 떨어져 나가 생성되었지만 여전히 염기서열을 확인하기 어려운 온전한 펩티드로 존재하게 된다. 따라서 추가적인 쪼개짐반응(MS3)을 통해 TurboSEQUEST 검색이 가능한 전형적인 y-ion 및 b-ion을 생성할 수 있는 것이다. 또한 그림7.에서 볼 수 있듯이 데이터베이스 검색결과와 일치하는 이온들은 한눈에 알아볼 수 있도록 각각의 색깔로 구분되어져 나타나며 펩티드서열 및 Phosphorylation의 위치도 자동으로 나타난다.

이와 같이, Finnigan LTQ Linearion Trap Mass Spectrometer의 새로운 기능 및 우수한 감도를 통해 10fmol의 낮은 농도에서도 펩티드를 자동으로 검출할 수 있으며, Data Dependent Neutral Loss Scanning Algorithm 및 TurboSEQUEST와 함께 Phosphorylation 된 위치까지도 정확하게 확인할 수 있다.